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    抗体体外亲和力成熟

    02-07

    抗体亲和力成熟(antibody affinity maturation)是动物免疫系统拥有的一种免疫功能状态。在体液免疫中,再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答,这种现象称为抗体亲和力成熟。其作用原理是由于抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对B细胞克隆的选择性激活。动物免疫系…

    抗体亲和力成熟(antibody affinity maturation)是动物免疫系统拥有的一种免疫功能状态。在体液免疫中,再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答,这种现象称为抗体亲和力成熟。其作用原理是由于抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对B细胞克隆的选择性激活。动物免疫系统的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果,对防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义。

    单克隆抗体已广泛地应用于临床治疗。目前,单克隆抗体的研发主要基于杂交瘤细胞或者体外抗体库,通过抗原和抗体亲和力筛选和功能验证,得到有药用潜力的抗体。在实际研发过程中,经过常规筛选所得的抗体,有诸多方面需要更细致的改进,包括亲和力、免疫原性、半衰期等??固迩缀土Φ奶岣哂兄诟纳瓶固宓奶匾煨院托Я?,有助于减少用药剂量,降低毒副作用等。发展抗体体外亲和力成熟的技术,不仅能够促进抗体药物的研发和质量改善,同时也能帮助我们更好地理解抗体与抗原靶点相互作用的机理,更好地认识抗原靶点的功能。

    基于抗体库的抗体体外亲和力成熟与基于体外抗体库的抗体筛选没有本质差别,都是体外筛选高亲和力抗体,其重点主要是两个方面,即抗体库的构建和筛选系统的选择。区别在于,抗体筛选所用的抗体库在构建或合成时无偏向性,而抗体体外亲和力成熟所用的抗体库是基于确定的抗体序列模板所构建。

    针对抗体体外亲和力成熟的建库策略可以大致分为两个类别:一类是构建大的抗体库,将抗体互补决定区域(CDR区域)甚至整个V区做随机突变;另一类是构建小的抗体库,将突变集中于抗体序列上特定的区域。 抗体大库构建的方法主要有:CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling、error-prone PCR等。1)CDR walking是分段随机突变同时保证相邻两个突变区域有所重叠,从而使突变覆盖整个CDR区域。(2)Chain shuffling是将抗体的VH和VL的配对重新洗牌。(3)DNA shuffling是将抗体V区的序列重新洗牌,其突变不限于CDR区,也包括FR区域。4)error-prone PCR则是对抗体进行随机突变。这些方法所构建的库的容量较大,工作量也较大。 与抗体大库的构建相比,抗体小库构建更有序列针对性。1)可以选择对抗体重链CDR3区域进行随机突变,因为重链 CDR3区域被认为通常对抗原抗体结合起关键作用。(2)另一种方法可以在抗体轻链和重链的6个CDR区域的所有氨基酸上进行突变,每一个氨基酸分别被突变成其他19个氨基酸(饱和突变),构成抗体饱和突变库。通过筛选抗体饱和突变库,可以识别出高亲和力的突变热点。通过组合这些突变热点,构建一个组合突变库,再进行筛选可以找到具有更高亲和力的组合。这种方法可以提高筛选效率,有效获得高亲和力抗体序列。3)胚系基因热点(germline hotspots)是体细胞高频突变过程中的优先突变区域,几乎都处于CDR区域内部,对抗体的亲和力提高起到关键作用,因此体外亲和力成熟时可优先考虑抗体的germline hotspots突变区域,在这些热点位置进行突变,构建抗体小库进行筛选。4)当抗体抗原复合物的结构被解析之后,可以通过分析两者相互作用的位点信息,进而进行更精确的突变和建库,有效获得高亲和力抗体序列。

    展示技术广泛用于抗体体外亲和力成熟。目前常用的噬菌体表面展示和酵母表面展示技术只能展示小分子片段抗体,如抗原结合片段(Fab),单链可变区抗体片段(scFv)等,无法展示并筛选全长抗体。通过噬菌体和酵母表面展示技术筛选出的抗体片段,需要进行结构转换,将抗体的片段结构转换成IgG全长抗体结构,应用于抗体药物开发。但是通过结构转换形成的全长抗体可能会部分或全部失去对抗原的结合活性,需要对转换后的全长抗体进一步进行体外成熟优化,才能筛选出具有高亲和力的抗体。

    最直接的策略是通过展示IgG全长抗体,进行体外亲和力成熟优化筛选。哺乳动物细胞表面展示技术能够有效地展示IgG全长抗体,还能够利用真核表达系统指导抗体的正确折叠,提供人源N型糖基化等多种翻译后加工功能,因而展示的抗体在分子结构、理化特性 和生物学功能方面最接近于天然的IgG全长抗体。但是与噬菌体展示和酵母展示技术相比,哺乳动物细胞表面展示技术通量小,操作难度大,周期长,成本高,无法高效达到体外亲和力成熟的目标。

    糖工程毕赤酵母具有类似于哺乳动物细胞的真核表达系统质量控制机制,能确??固宓恼氛鄣?,具有人源N型糖基化等多种翻译后加工功能。糖工程毕赤酵母细胞表面展示技术能够有效地展示IgG全长抗体,其表面展示的IgG抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然抗体。与哺乳动物细胞展示技术相比,糖工程毕赤酵母展示技术具有抗体库容量大,操作简单,周期短,成本低,能高通量筛选IgG全长抗体。糖工程毕赤酵母可以代替噬菌体、酵母细胞展示技术,构建大容量人源IgG全长抗体库,进行高通量亲和力体外成熟筛选,选出的高亲和力、高表达IgG全长抗体不需要结构形式改变,可以直接表达生产进行动物实验和临床实验,是一种稳定高效的抗体亲和力成熟系统。因此糖工程毕赤酵母展示技术具有其他展示技术没有的潜在优势。

    免疫磁珠分离技术(MACs)和流式细胞分?。?/span>FACs)可以高通量筛选富集与靶标抗原特异性结合抗体。免疫磁珠法分离细胞基于糖工程毕赤酵母和哺乳动物细胞表面抗体能与连接在磁珠上的抗原相结合,在外磁场中细胞通过表面展示的高亲和力抗体与抗原磁珠相连被吸附而滞留在磁场中,细胞表面展示的抗体如果没有亲和力,则不能与抗原磁珠结合而没有磁性,不会在磁场中停留。FACS分选技术可以同时根据IgG全长抗体亲和力及表达展示水平进行筛选,可以消除表达水平不同引起的偏差,而且能区分亲和力不同的克隆,一次直接分选不同亲和力的抗体克隆。

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